抗衰老-端粒指标

一、实验目的

衰老是生物体渐进性损伤累积和功能退化的过程，最终导致环境适应能力下降、疾病易感和死亡风险增加。因此，衰老是许多与年龄相关疾病病的主要风险因素。生物的衰老进程涉及诸多病理、生理因素，具有渐进性、阶段性、复杂性和多样性特点。端粒是由短的富含G的串联重复序列和在真核染色体末端发现的蛋白质组成的结构。端粒的一个主要功能是保护染色体末端不被识别为双链DNA断裂。端粒重复序列的长度可能以两种方式影响结构。首先，形成T形环需要最小长度。其次，有人提出端粒处于有上限状态和无上限状态之间的平衡状态，并且根据端粒长度，平衡可能会转移到这些状态之一。端粒重复序列的丧失与肿瘤发生和衰老过程有关。因此，人们对准确测量人类和模式生物的端粒长度非常感兴趣。秀丽隐杆线虫具有生命周期短、遗传资源丰富、关键信号通路与人类高度同源、实验操作与维护简单等优点，已成为探寻衰老相关机制、构建衰老相关模型的强有力模型，也被证明是研究端粒功能的重要多细胞模式生物。该测试项目评价样品对线虫端粒酶活性及端粒长度的影响，评价其抗衰老的功效。

二、建模原理

不需要建模处理。

三、实验方案

3.1 最大检测浓度摸索

①实验动物：同步化的L4期野生型N2线虫。

②实验分组：对照组、每个样品3个剂量组。

③实验方法：将L4期野生型N2线虫转移到按表1体系配制的96孔板中，在20 ℃、120 rpm条件下培养48 h以后，在倒置显微镜下观察并记录线虫是否存在大量死亡的现象。每组线虫数量不少于30条。

表1 MTC实验培养体系

3.2 样品对端粒酶活性的影响

①实验动物：同步化的L4期野生型N2线虫。

②实验分组：对照组、每个样品1个剂量组。

③实验方法：移取同步化的L4期野生型N2线虫到按以下体系配置的48孔板（每孔总体积500 μL）中。孔板中AMP的终浓度为100 μg/mL、5-FUdR的终浓度为75 μg/mL以及NA22的终浓度约为0.6（OD 570 nm），控制每孔200-300条线虫，每组设置3个复孔。在20 ℃、120 rpm条件下培养至Day 10，收集线虫并用M9缓冲液清洗以去除大肠杆菌，然后通过自动组织研磨机均质化，经低温离心（4℃，12000 r/min，10 min）后收集上清液4℃放置待测。根据线虫端粒酶检测试剂盒提供的说明书进行测定，结果通过蛋白质浓度标准化。

表2 端粒实验培养体系

④检测指标：老年色素含量。

3.3 样品对端粒长度的影响

①实验动物：同步化的L4期野生型N2线虫。

②实验分组：对照组、每个样品1个剂量组。

③实验方法：移取同步化的L4期野生型N2线虫到按表2体系配置的48孔板（每孔总体积500 μL）中。控制每孔200-300条线虫，每组设置3个复孔。在20 ℃、120 rpm条件下培养至Day 10，收集线虫并根据商用DNA纯化试剂盒提取线虫的基因组DNA。分别以线虫端粒重复序列（TTAGGC）引物和内参基因（tba-1）引物进行RT-qPCR反应，计算得到相对端粒长度。

④检测指标：相对端粒长度。