抗衰老-抗热应激

一、实验目的

衰老是生物体渐进性损伤累积和功能退化的过程，最终导致环境适应能力下降、疾病易感和死亡风险增加。因此，衰老是许多与年龄相关疾病病的主要风险因素。生物的衰老进程涉及诸多病理、生理因素，具有渐进性、阶段性、复杂性和多样性特点。从整体动物表型层面来看，衰老的主要特征包括抗胁迫能力下降、机体功能减退、退行性疾病发生率增大、死亡风险升高等。López-Otín等科学家最近提出了衰老的十二个主要特征，包括基因组不稳定、端粒消耗、表观遗传改变、蛋白稳态失衡、巨噬细胞功能丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞衰竭、细胞间通讯改变、慢性炎症和菌群失调。秀丽隐杆线虫具有生命周期短、遗传资源丰富、关键信号通路与人类高度同源、实验操作与维护简单等优点，已成为探寻衰老相关机制、构建衰老相关模型的强有力模型。该测试项目评价样品对线虫热应激蛋白的影响，评价其抗衰老的功效。

二、建模原理

TJ375线虫模型{gpIs1 [hsp-16.2p::GFP]}：在35 ℃下热休克> 1 h后诱导发出GFP绿色荧光。

三、实验方案

3.1 最大检测浓度摸索

①实验动物：同步化的L4期TJ375线虫。

②实验分组：对照组、每个样品3个剂量组。

③实验方法：将L4期TJ375线虫转移到按表1体系配制的96孔板中，在20 ℃、120 rpm条件下培养48 h以后，在倒置显微镜下观察并记录线虫是否存在大量死亡的现象。每组线虫数量不少于30条。

表1 MTC实验培养体系

3.2 样品对热应激的影响

①实验动物：同步化的L4期TJ375线虫。

②实验分组：对照组、每个样品1个剂量组。

③实验方法：移取同步化的L4期TJ375线虫到按表2体系配置的48孔板（每孔总体积500 μL）中。孔板中AMP的终浓度为100 μg/mL、5-FUdR的终浓度为75 μg/mL以及NA22的终浓度约为0.6（OD 570 nm），控制每孔200-300条线虫加入到孔板中，每组设置3个复孔。在20 ℃、120 rpm条件下培养48 h后，将孔板转移至35 ℃、120 rpm条件下培养2 h以诱导热休克反应，然后再将孔板转移回20 ℃、120 rpm条件下培养24 h。收集并清洗线虫，用左旋咪唑麻醉后在荧光显微镜下成像，利用Image J软件量化获得荧光强度。

表2 抗热应激实验培养体系

④检测指标：HSP16.2::GFP绿色荧光强度。

⑤荧光照片示例图：