抗衰老-氧化存活

一、实验目的

氧化胁迫被认为是在高浓度的活性氧，如超氧自由基、羟基自由基和过氧化氢等情况下，出现的脂质、蛋白质和核酸等生物大分子的氧化损伤，以及细胞新陈代谢被破坏的一种状态。活性氧自由基（ROS）是氧化胁迫产生的主要物质基础，产生于细胞正常的新陈代谢过程中。正常生理条件下，机体可以通过抗氧化防御系统，如抗氧化酶等使ROS保持在一个适当的水平，以正常行使其调节细胞功能的生理学作用。当 ROS的产生与清除系统功能失衡，或者机体受到外界环境或胁迫条件的影响，如紫外照射、氧化剂处理等，会产生过多的活性氧自由基，造成氧化胁迫，导致非特异性细胞损伤，破坏细胞功能，影响新陈代谢。秀丽隐杆线虫具有生命周期短、遗传资源丰富、关键信号通路与人类高度同源、实验操作与维护简单等优点。该测试项目评价样品对线虫氧化存活的影响，评价其抗氧化的功效。

二、建模原理

百草枯和过氧化氢能够高效诱导线虫体内产生大量活性氧（ROS），从而模拟氧化应激的病理状态。

三、实验方案

3.1 最大检测浓度摸索

①实验动物：同步化的L4期野生型N2线虫。

②实验分组：对照组、每个样品3个剂量组。

③实验方法：将L4期野生型N2线虫转移到按表1体系配制的96孔板中，在20 ℃、120 rpm条件下培养48 h以后，在倒置显微镜下观察并记录线虫是否存在大量死亡的现象。每组线虫数量不少于30条。

表1 MTC实验培养体系

3.2 样品对百草枯氧化存活的影响

①实验动物：同步化的L4期野生型N2线虫。

②实验分组：对照组、每个样品1个剂量组。

③实验方法：移取同步化的L4期野生型N2线虫到按表2体系配置的96孔板（每孔总体积100 μL）中。孔板中AMP的终浓度为100 μg/mL、5-FUdR的终浓度为75 μg/mL以及NA22的终浓度约为0.5（OD 570 nm），控制每孔10-15条线虫加入到孔板中，每组设置6个复孔。在20 ℃、120 rpm条件下培养24 h后，向每组中加入终浓度为50 mM的百草枯溶液进行造模处理，继续在20 ℃、120 rpm条件下培养。此时对秀丽线虫计数，此后每12 h进行一次计数，直至线虫全部死亡。

表2 氧化存活实验培养体系

④检测指标：百草枯氧化存活。

3.3 样品对过氧化氢氧化存活的影响

①实验动物：同步化的L4期野生型N2线虫。

②实验分组：对照组、每个样品1个剂量组。

③实验方法：移取同步化的L4期野生型N2线虫到按表2体系配置的96孔板（每孔总体积100 μL）中。孔板中AMP的终浓度为100 μg/mL、5-FUdR的终浓度为75 μg/mL以及NA22的终浓度约为0.5（OD 570 nm），控制每孔10-15条线虫加入到孔板中，每组设置6个复孔。在20 ℃、120 rpm条件下培养24 h后，向每组中加入终浓度为5 mM的过氧化氢溶液进行造模处理，继续在20 ℃、120 rpm条件下培养。此时对秀丽线虫计数，此后每2 h进行一次计数，直至线虫全部死亡。

④检测指标：过氧化氢氧化存活。