线粒体保护

一、实验目的

线粒体是真核细胞中半自主的细胞器，根据内共生理论，它是细菌起源的，并且在宿主细胞和线粒体之间形成了共生关系。线粒体通过电子传递连接的磷酸化（也称为氧化磷酸化（OXPHOS））产生小分子化学能储存，称为三磷酸腺苷（ATP），并且线粒体在生物合成途径中也发挥着多方面的作用，是脂肪酸、氨基酸和葡萄糖等物质合成的重要来源，例如，线粒体是合成谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸等氨基酸的重要枢纽。此外，随着研究的深入，线粒体还被发现在细胞因子、活性氧（ROS）的产生、维持细胞信号传导的钙稳态、程序性细胞死亡和细胞凋亡中发挥重要作用。因此，线粒体被认为是细胞中多功能的关键细胞器，当线粒体的结构与功能出现异常时，会导致多种疾病的发生。秀丽线虫简单且特征明确的细胞组成、半透明的身体、易于基因操作以及较短的寿命为在动物一生中体内检查单个细胞中的线粒体提供了显着的优势，可以在整个生命过程中进行线粒体结构和功能的研究，而目前在任何其他生物体内都无法轻易进行这种研究。该测试项目评价样品对线虫正常线粒体含量的影响，评价其线粒体保护的功效。

二、建模原理

SJ4143线虫模型{zcIs17 [ges-1::GFP(mit)]}：在肠道线粒体中特异性表达绿色GFP荧光。

鱼藤酮是线粒体复合物I的特异性抑制剂，可以触发一系列包括能量衰竭、氧化应激爆发、膜电位崩溃乃至细胞凋亡在内的连锁反应，最终模拟出与人类线粒体疾病和神经退行性疾病相关的病理状态。

三、实验方案

3.1 最大检测浓度摸索

①实验动物：同步化的L4期SJ4143线虫。

②实验分组：对照组、每个样品3个剂量组。

③实验方法：将L4期SJ4143线虫转移到按表1体系配制的96孔板中，在20 ℃、120 rpm条件下培养48 h以后，在倒置显微镜下观察并记录线虫是否存在大量死亡的现象。每组线虫数量不少于30条。

表1 MTC实验培养体系

3.2 样品对正常线粒体含量的影响

①实验动物：同步化的L4期SJ4143线虫。

②实验分组：对照组、模型组、每个样品1个剂量组。

③实验方法：移取同步化的L4期SJ4143线虫到按表2体系配置的48孔板（每孔总体积500 μL）中。孔板中AMP的终浓度为100 μg/mL、5-FUdR的终浓度为75 μg/mL以及NA22的终浓度约为0.6（OD 570 nm），控制每孔200-300条线虫加入到孔板中，每组设置3个复孔。在20 ℃、120 rpm条件下培养24 h后，除对照组外向每组中加入终浓度为1 μM的鱼藤酮溶液进行造模处理，继续在20 ℃、120 rpm条件下培养48 h。收集并清洗线虫，采用终浓度为1 μm的TMRE红色染料进行染色6 h处理。再脱色30 min后拍摄荧光照片，利用Image J软件量化获得荧光强度，通过计算获得线虫的正常线粒体含量。

表2 正常线粒体含量实验培养体系

④检测指标：正常线粒体含量。

⑤荧光照片示例图：