摘要

甘蔗梢富含酚类化合物。以往研究多关注游离多酚的作用，而结合态多酚常被忽视。本研究发现，甘蔗梢中结合态多酚（SPB）含量（31.9±0.9 mg GAE/g 干重）显著高于游离多酚（SPF）（3.4±0.1 mg GAE/g 干重）。通过超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）鉴定出 44 种游离酚类化合物和 31 种结合态酚类化合物。此外，结合态多酚的抗氧化活性更为显著，其 ABTS 和 DPPH 自由基清除率均高于游离多酚，这一特性归因于其更高的单宁含量。在所有测试浓度（100 μg/mL 和 200 μg/mL）下，结合态多酚均能显著提高秀丽隐杆线虫（C. elegans）的存活率和抗氧化酶活性，同时降低活性氧（ROS）水平。高浓度结合态多酚的抗氧化活性甚至可与维生素 C（Vc）媲美。研究结果表明，甘蔗梢结合态多酚具有作为高效抗氧化剂的巨大潜力。

1 引言

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是重要的农作物，因其蔗糖生产带来的经济价值而享誉全球。统计数据显示，全球甘蔗年产量约为 19 亿吨（联合国粮食及农业组织统计数据库，FAOSTAT）。甘蔗制糖过程中会产生一系列副产品，其中甘蔗梢约占甘蔗植株总生物量的 25%（Khaire 等人，2021）。近年来，利用甘蔗副产品已成为提高甘蔗附加值的有效途径，相关研究关注度日益提升（Ali 等人，2021；Hewawansa 等人，2024；Rabelo 等人，2020）。然而，甘蔗梢的利用目前仍主要集中在焚烧和饲料加工，附加值相对较低（Khaire 等人，2021）。作为甘蔗的生长部位，甘蔗梢含糖量较低，且富含天然活性成分，是优质的酚类化合物来源。

多酚是一类结构多样且研究广泛的次生代谢物，其特征是芳香环上连接多个酚羟基，主要分为黄酮类、酚酸类、二苯乙烯类、木脂素类及其他酚类化合物。这类化合物主要在植物界合成，在植物抵御紫外线辐射、微生物感染、植食性动物侵害等生物和非生物胁迫中发挥关键作用。多酚的结构多样性涵盖了从简单酚酸到大型聚合单宁的广泛分子量和复杂度范围，这种结构差异使其具有多种生物活性，包括预防癌症、心脑血管疾病，抑制氧化应激和炎症，以及调节免疫活性等（Rana 等人，2022；Singh 等人，2018）。多酚广泛存在于香料、水果、蔬菜、茶叶、葡萄酒等多种植物性食物中，在人类营养与健康领域具有重要意义，已成为生物化学、药理学和临床营养学的研究热点。根据溶解特性，多酚可分为两类：一类是游离多酚，可通过水 - 有机溶剂提取，又称可提取多酚；另一类是结合态多酚，存在于游离多酚提取后的残渣中，通过醚键、酯键和糖苷键与膳食纤维、蛋白质等分子共价结合（Acosta-Estrada 等人，2014；Huang 等人，2023）。结合态多酚的提取难度较大，常规有机溶剂提取法无法奏效，需采用水解法释放，因此也被称为不可提取多酚。在植物多酚的化学和生物学研究中，大多数研究聚焦于更易提取的游离多酚，而大量结合态多酚被丢弃，这也导致植物多酚的总酚含量和营养价值被低估。尽管目前关于结合态多酚对膳食多酚的贡献相关研究有限，但已有证据表明，结合态多酚可能是植物多酚的主要成分之一，且与多种健康益处相关（Arranz 等人，2009；Zhang 等人，2020）。因此，开展结合态多酚研究可为植物多酚研究提供理论补充，为植物多酚的应用提供理论支持。

近年来，甘蔗活性成分的研究与利用取得了显著进展，但关于甘蔗梢活性多酚的文献仍较为匮乏。以往研究多关注甘蔗中游离多酚的生物活性（Iwata 等人，2022；Wang 等人，2018），对甘蔗及甘蔗梢中多酚的价值评估存在较大偏差，且未明确甘蔗的酚类成分构成。本研究旨在填补这一研究空白，对甘蔗梢中游离多酚与结合态多酚进行比较分析。采用传统溶剂法提取甘蔗梢游离多酚（SPF），碱水解法提取结合态多酚（SPB），通过单因素实验和 Box-Behnken 设计（BBD）优化结合态多酚的提取工艺；利用扫描电子显微镜（SEM）和 X 射线衍射仪（XRD）分析多酚的释放机制；结合比色法和 UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 技术鉴定并比较 SPF 和 SPB 的酚类成分；通过体外抗氧化实验和以秀丽隐杆线虫为模式生物的体内实验，对比研究 SPF 和 SPB 的抗氧化活性，并探讨酚类成分与抗氧化活性的关系。本研究为深入了解甘蔗梢多酚提供了更全面的信息，为其可靠应用提供了理论支持。

2 材料与方法

2.1 植物材料

甘蔗梢是甘蔗茎的顶端部分，也是甘蔗茎的生长点所在，包含嫩茎、叶鞘和叶片（Zhou、Wang 等人，2023）。2023 年 2 月，从中国崇左市扶绥县甘蔗基地采集桂糖 42 号甘蔗梢。新鲜甘蔗梢在 45℃下烘干，粉碎后过 100 目筛，于 - 20℃冰箱中储存备用。

2.2 试剂与菌株

福林-乔卡梯乌试剂（Folin-Ciocalteu reagent）、2,2'- 联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）铵盐（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和百草枯购自上海麦克林生化科技有限公司；所有标准品购自上海源叶生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；秀丽隐杆线虫菌株（Bristol，N2）和大肠杆菌 OP50 由明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）惠赠；其他化学试剂均为分析纯。

2.3 游离多酚（SPF）的提取

采用常规有机溶剂提取法提取 SPF（Yang 等人，2022）。称取1 g甘蔗梢粉末，加入 10 mL 60% 乙醇，在 37℃、200 rpm 的恒温摇床上提取2 h。过滤分离提取液与固体残渣，向残渣中再次加入 10 mL 60% 乙醇重复提取，直至福林 - 乔卡梯乌法检测不到提取液中的多酚。合并提取液，旋转蒸发去除乙醇，提取液冷冻干燥，固体残渣烘干，均于 - 20℃储存备用。

2.4 结合态多酚（SPB）的提取

采用碱水解法制备 SPB（Zheng 等人，2020）。将提取 SPF 后的干残渣用氢氧化钠溶液水解，在 37℃、200 rpm 的恒温摇床上进行。水解完成后，用硫酸溶液将混合液 pH 值调至 2.0，加入 2 倍体积的无水乙醇提取结合态多酚。过滤分离提取液与固体残渣，提取液旋转蒸发去除乙醇，冷冻干燥后于 - 20℃储存备用；固体残渣烘干备用。

2.4.1 单因素实验

以提取率为响应值，考察氢氧化钠浓度（X₁：1-10 mol/L）、碱水解时间（X₂：1-6 h）和液固比（X₃：10-30 mL/g）三个因素对 SPB 提取的影响。

2.4.2 Box-Behnken 设计（BBD）

基于单因素实验结果，采用 BBD 优化 SPB 提取工艺。将三个因素编码为三个水平（-1、0、1），设计 17 组实验，考察各因素对 SPB 提取率的影响（表 S1）。

2.5 残渣的表面微观结构分析

2.5.1 扫描电子显微镜（SEM）分析

采用日立 SU8220 扫描电子显微镜，在 3000 倍和 5000 倍放大倍数下观察甘蔗梢及其残渣的表面微观结构。

2.5.2 X 射线衍射（XRD）分析

采用丹东浩源仪器有限公司 DX-2700A X 射线衍射仪测定甘蔗梢及其残渣的结晶度。扫描范围为 5°-60°，扫描速度 4°/min，管电压 40 kV，管电流 30 mA。

2.6 多酚的植物化学分析

2.6.1 总酚含量（TPC）测定

采用福林 - 乔卡梯乌法：取 100 μL 样品溶液与 100 μL 福林-乔卡梯乌试剂在室温下反应 6 min，依次加入 1000 μL 7% 碳酸钠溶液和 800 μL 蒸馏水，孵育 90 min 后，在 760 nm 波长下测定吸光度。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，结果以 mg 没食子酸当量 /g 干重（mg GAE/g DW）表示。

2.6.2 总黄酮含量（TFC）测定

采用三氯化铝比色法：取 750 μL 样品溶液与 45 μL 5% 亚硝酸钠溶液混合，暗处反应 5 min 后，依次加入 45 μL 10% 三氯化铝溶液、300 μL 1 mol/L 氢氧化钠溶液和 360 μL 蒸馏水，充分混匀后在 510 nm 波长下测定吸光度。以芦丁为标准品绘制标准曲线，结果以 mg 芦丁当量 /g 干重（mg RE/g DW）表示。

2.6.3 总单宁含量（TTC）测定

采用福林-丹尼斯法：取 25 μL 样品溶液与 200 μL 福林-丹尼斯试剂混合，加入 125 μL 7% 碳酸钠溶液，暗处反应 30 min 后，在 760 nm 波长下测定吸光度。以单宁酸为标准品绘制标准曲线，结果以 mg 单宁酸当量 /g 干重（mg TAE/g DW）表示。

2.6.4 总酚酸含量（TPAC）测定

参考 Godočiková 等人（2019）的方法：向 0.5 mL 样品溶液中加入 0.5 mL 0.5 mol/L 盐酸溶液，再加入 0.5 mL 阿诺试剂（100 g/L 亚硝酸钠溶液与 100 g/L 钼酸钠溶液混合），随后加入 0.5 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液和 0.5 mL 蒸馏水，在 490 nm 波长下测定吸光度。以咖啡酸为标准品绘制标准曲线，结果以 mg 咖啡酸当量 /g 干重（mg CAE/g DW）表示。

2.6.5 UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 分析

采用沃特世 ACQUITY UPLC I-Class 系统，配备沃特世 Cyclic Q-TOF 质谱仪和 ESI 离子源进行酚类成分鉴定。色谱柱为 ACQUITY UPLC® BEH C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为 0.1% 甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱程序：0-13 min，5%-100% B；13-13.1 min，100%-5% B；13.1-15 min，5% B；进样量 2 μL，柱温 40℃，流速 0.3 mL/min。质谱采用负离子模式，质量扫描范围 50-650 Da；雾化气为氮气，碰撞气为氦气；毛细管电压 2.5 kV，锥孔电压 40 V，源偏移电压 10 V，离子源温度 100℃，溶剂气温度 280℃，溶剂气流速 800 L/h。

2.7 体外抗氧化活性测定

2.7.1 ABTS⁺自由基清除率测定

参考 Shen 等人（2016）的方法并稍作修改：将 7.4 mmol/L ABTS 溶液与 2.6 mmol/L 过硫酸钾溶液按 1:1 比例混合，室温暗处放置 12 h 制备 ABTS⁺储备液；用蒸馏水稀释储备液至 734 nm 波长下吸光度为 0.70±0.02，得到工作液。取 50 μL 样品溶液与 200 μL 工作液混合，室温暗处反应 6 min 后，在 734 nm 波长下测定吸光度。以 Vc 为阳性对照，ABTS⁺自由基清除率计算公式如下：\(ABTS^{+}自由基清除率 =\left(1-\frac{As-Ac}{Ab}\right) × 100\)其中，As 为样品组吸光度，Ab 为空白组吸光度，Ac 为对照组吸光度。

2.7.2 DPPH 自由基清除率测定

参考 Xie 等人（2021）的方法并稍作修改：取 100 μL 样品溶液与 100 μL 0.1 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液混合，室温暗处反应 30 min 后，在 517 nm 波长下测定吸光度。以 Vc 为阳性对照，DPPH 自由基清除率计算公式如下：\(DPPH自由基清除率 =\left(1-\frac{As-Ac}{Ab}\right) × 100\)其中，As 为样品组吸光度，Ab 为空白组吸光度，Ac 为对照组吸光度。

2.8 体内抗氧化活性测定

2.8.1 秀丽隐杆线虫的培养与同步化

秀丽隐杆线虫在含有 OP50 大肠杆菌（作为食物源）的线虫生长培养基（NGM）上培养，温度控制在 20℃左右。采用次氯酸钠法对秀丽隐杆线虫进行同步化处理，用于后续实验。

2.8.2 存活率测定

在涂有 OP50 大肠杆菌的 NGM 培养基中加入不同浓度的 SPF 和 SPB（100 μg/mL 和 200 μg/mL），将同步化后的 L1 期线虫转移至该培养基中培养 48 h。每组取约 30 条线虫转移至含 50 mmol/L 百草枯的 96 孔板中进行应激处理，定期观察并记录线虫死亡率，计算存活率。

2.8.3 ROS 水平测定

按照 2.8.2 的方法培养线虫，用生理盐水清洗后，在 50 mmol/L 百草枯中应激处理 2 h。应激结束后，用生理盐水清洗线虫 3 次，加入 20 μmol/L DCFH-DA 溶液，20℃孵育 30 min。采用徕卡 DM4B 显微镜观察并拍照，通过 Image J 软件分析平均荧光强度，评估线虫体内 ROS 积累水平。

2.8.4 抗氧化酶活性测定

按照 2.8.2 和 2.8.3 的方法处理线虫，根据 SOD 和 CAT 试剂盒说明书测定线虫体内的酶活性。

2.9 统计分析

所有数据以平均值 ± 标准差表示，每个数据点至少重复 3 次。采用 IBM SPSS V.26.0 统计软件进行统计分析，Design Expert V.10.0 软件进行响应面数据分析，以 p<0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 SPF 和 SPB 的提取

经三次重复提取，甘蔗梢中游离多酚含量为 3.4±0.1 mg GAE/g 干重。

本研究中，氢氧化钠浓度、碱水解时间和液固比是影响 SPB 提取的主要因素。如图 1A 所示，SPB 提取率随氢氧化钠浓度的升高呈先升后降的趋势，在浓度为 8 mol/L 时达到最大值 30.1±0.1 mg GAE/g 干重。这可能是因为较高浓度的氢氧化钠溶液能更高效、快速地破坏多酚与细胞壁基质之间的酯键和醚键，促进结合态酚类化合物释放；但浓度过高会破坏酚羟基，降低化合物的化学稳定性（Zhong 等人，2022）。图 1B 显示，在 1-6 h 范围内，SPB 提取率随水解时间延长显著升高，5 h 时达到最大值 29.0±0.6 mg GAE/g 干重，进一步延长水解时间则提取率显著下降，这是由于长时间碱水解会导致多酚降解或氧化（Zhong 等人，2022）。图 1C 显示，在 10-30 mL/g 范围内，SPB 提取率随液固比增加先显著升高后显著下降，液固比为 25 mL/g 时达到最大值 29.0±0.3 mg GAE/g 干重。液固比增加可降低反应体系的传质阻力，加速多酚溶解释放，但过高的液固比可能降低溶剂与原料的接触效率，影响结合态多酚的溶解释放（Zhong 等人，2022）。

图 1 不同因素及其交互作用对结合态多酚（SPB）提取率的影响（A）氢氧化钠浓度 （B）碱水解时间 （C）液固比（mL/g）（D）氢氧化钠浓度 - 碱水解时间交互作用 （E）碱水解时间 - 液固比交互作用 （F）氢氧化钠浓度 - 液固比交互作用。

基于单因素实验结果，采用 BBD 优化 SPB 提取工艺，实验方案和结果见表 S2。模型生成的响应面三维图和二维等高线图（图 1D-F）显示了各因素交互作用对提取率的影响。

如表 S3 所示，X₂（F=48.85，p=0.0002<0.001）对提取率有极显著影响，X₂²（F=8.99，p=0.02<0.05）有显著影响，表明液固比和碱水解时间的非线性效应是影响提取率的主要因素。模型的 F 值为 7.77，p 值为 0.0066，R² 为 0.9090，变异系数（CV%）为 3.15%，表明模型可靠且重复性良好，可用于预测甘蔗梢结合态多酚的提取结果。优化后的提取工艺参数为：氢氧化钠浓度 8.30 mol/L，碱水解时间 4.99 h，液固比 24.74 mL/g，预测多酚提取率为 31.18 mg GAE/g 干重。结合实际条件调整后，最终工艺参数为：氢氧化钠浓度 8.3 mol/L，碱水解时间 5.0 h，液固比 25.0 mL/g，实际多酚提取率为 31.9±0.9 mg GAE/g 干重，与预测值一致。

显然，甘蔗梢中 SPB 含量是 SPF 的 9 倍以上，这与板栗壳的相关研究结果一致（Yang 等人，2023）。这可能是因为甘蔗生长代谢过程中，多酚易与细胞壁成分结合。已有大量研究关注多酚与植物细胞壁成分（如多糖、蛋白质）的相互作用（Guo 等人，2022；Yan 等人，2023），多酚与大分子结合可能有助于其在植物体内稳定存在并保持生物活性（Buchweitz 等人，2013）。但这一现象并非存在于所有植物中，多数果蔬中的酚类化合物以游离态为主（Zhou、Zhong 等人，2023）。值得注意的是，以往研究表明，甘蔗不同部位提取的多酚产量仅约为 2.6-8.7 mg GAE/g 干重（Feng 等人，2014），可见甘蔗中大量结合态多酚被忽视和浪费。

3.2 残渣的表面微观结构分析

3.2.1 SEM 分析

原料表面光滑平整，纤维层结构清晰可见（图 2A），纤维层表面存在块状和球状物质，为残留的蛋白质聚合物和淀粉小颗粒（Wen 等人，2017）。乙醇提取游离多酚后的甘蔗梢残渣表面脆化、粗糙不平，出现少量孔洞（图 2B），这是由于乙醇溶解了附着在甘蔗梢表面的游离多酚等小分子物质。碱水解提取结合态多酚后，残渣表面结构发生显著变化，变得疏松并出现大量碎屑（图 2C），这是因为碱水解对甘蔗梢的层状纤维素结构造成了显著破坏，从而促进结合态多酚释放，这与 Huang 等人（2023）的研究结果一致。

图 2 残渣的表面微观结构分析（A）原料、（B）游离多酚（SPF）提取后残渣、（C）结合态多酚（SPB）提取后残渣的扫描电子显微镜（SEM）观察结果（每个样品分别在 3000 倍（编号 1）和 5000 倍（编号 2）放大倍数下观察）（D）甘蔗梢及其残渣的 X 射线衍射（XRD）分析结果。

3.2.2 XRD 分析

如图 2D 所示，未经过提取处理的甘蔗梢和游离多酚提取后的残渣均表现出典型的 I 型纤维素晶体特征，在 2θ 为 21.5° 和 16.2° 处出现两个明显的结晶峰（Yang 等人，2021）。而结合态多酚提取后的甘蔗梢残渣表现出典型的 II 型纤维素特征，在 2θ 为 20°-22° 之间出现两个衍射峰（20° 和 21.5°），并在低角度（2θ=12.5°）出现一个结晶峰（de Morais Teixeiraa 等人，2011）。从 16.2° 到 12.5° 的峰位迁移以及 21.5° 峰分裂为两个峰，表明纤维素从 I 型转变为 II 型。这种晶体结构变化并非乙醇处理导致，而是碱水解成功再生无定形纤维素的结果，碱水解后甘蔗梢结晶度的提高也支持这一结论。碱水解过程中，共价键断裂导致纤维层间距扩大，纤维素分子在氢键和范德华力作用下重新结合，形成更稳定的 II 型纤维素晶体结构（Ahmadzadeh 等人，2018）。值得注意的是，这一过程中共价键的断裂会释放此前与大分子结合的多酚。

3.3 SPF 和 SPB 的酚类成分

3.3.1 TPC、TFC、TTC 和 TPAC 比较

采用比色法对 SPF 和 SPB 的成分进行初步分析，结果如图 3 所示，两者成分存在显著差异。SPF 的总黄酮含量（TFC）和总酚酸含量（TPAC）高于 SPB，分别为 513.4±3.5 mg RE/g 和 153.7±3.2 mg CAE/g；SPB 的总酚含量（TPC）和总单宁含量（TTC）分别为 533.9±5.7 mg GAE/g 和 408.4±1.8 mg TAE/g，分别是 SPF 的 2.3 倍和 1.8 倍以上。

图 3 游离多酚（SPF）与结合态多酚（SPB）中总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、总单宁含量（TTC）及总酚酸含量（TPAC）的差异。

3.3.2 UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 分析

采用 UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 进一步鉴定 SPF 和 SPB 的酚类成分，总离子流图如图 4 所示。结果表明，SPF 和 SPB 共含有 56 种酚类化合物（表 1）。

图 4 游离多酚（SPF）与结合态多酚（SPB）在负离子模式下的总离子流图。

3.3.2.1 黄酮类化合物

SPF 和 SPB 中共鉴定出 32 种黄酮类化合物，包括 7 种黄酮、9 种黄酮醇、3 种黄烷酮、1 种黄烷醇、3 种异黄酮、4 种异黄烷酮、1 种异黄烷醇、2 种奥弄醇和 2 种 2-芳基苯并呋喃类黄酮。

• 黄酮类：SPF 中鉴定出 6 种黄酮，其中 2 种也存在于 SPB 中。化合物 18（保留时间 3.097 min，m/z 447.0945 [M-H]⁻）根据碎片离子 m/z 429.0842 和 285.0407 鉴定为木犀草素 4'-葡萄糖苷（Picos-Salas 等人，2024）；化合物 21（保留时间 3.337 min，m/z 563.1429 [M-H]⁻）根据碎片离子 m/z 533.1315 [M-H-CH₂O]⁻和 413.0892 [M-H-C₅H₁₀O₅]⁻鉴定为芹菜素 6-C - 葡萄糖苷 8-C - 阿拉伯糖苷，该化合物已在甘蔗糖蜜中被报道（Deseo 等人，2020）；其余 4 种黄酮分别为白杨素 7-[鼠李糖基 -(1→4)- 葡萄糖苷]、獐牙菜苷、5,7 - 二羟基-6-甲氧基黄酮 5-鼠李糖苷和 3,7-二甲基槲皮素。

• 黄酮醇类：SPF 和 SPB 中分别鉴定出 8 种和 7 种黄酮醇。化合物 11、16、33 和 56 分别鉴定为芦丁（Hoffmann 等人，2017）、山奈酚 3-O-葡萄糖基-(1→2)- 鼠李糖苷（Sun 等人，2022）、山奈酚 3 - 葡萄糖醛酸苷（Zhou 等人，2018）和杨梅素（Hvattum 等人，2004）；其余黄酮醇包括山奈酚 3-木糖基葡萄糖苷、山奈酚 3-阿拉伯呋喃糖苷 7-鼠李呋喃糖苷、高良姜素 3-[半乳糖基 -(1→4)- 鼠李糖苷]、风信子素和山奈酚 3-(2''- 对香豆酰葡萄糖苷)。

• 黄烷酮类：SPB 中含有 3 种黄烷酮，SPF 中仅鉴定出 1 种（化合物 32）。化合物 12（保留时间 2.788 min，m/z 271.0613 [M-H]⁻）根据碎片离子 m/z 253.0525、229.0494 和 151.0049 鉴定为柚皮素（Yu 等人，2021）；化合物 32 和 41 分别鉴定为甘草素 4'-[3 - 乙酰基芹菜糖基 -(1→2)- 葡萄糖苷] 和 5-O - 甲基圣草酚 7 - 葡萄糖基 -(1→4)- 半乳糖苷。

• 黄烷醇类：SPF 中鉴定出 1 种黄烷醇，为黄杉素 7 - 鼠李糖苷。

• 异黄酮类：SPF 中鉴定出 3 种异黄酮，其中仅化合物 20 存在于 SPB 中。化合物 20（保留时间 3.202 min）根据前体离子 m/z 461.1098 [M+FA-H]⁻及碎片离子 m/z 341.0684 和 313.0364 鉴定为染料木素 4''-鼠李糖苷；化合物 36 和 38 分别鉴定为樱黄素 4'-O-葡萄糖苷和芒柄花素 7-O-葡萄糖醛酸苷。

• 异黄烷酮类：SPF 中含有 2 种异黄烷酮，SPB 中含有 3 种。化合物 10 鉴定为二氢大豆苷元（Prasain 等人，2004）；化合物 24、42 和 44 分别鉴定为 5-脱氧凯维酮氢酸、凯维酮和凯维醇。

• 异黄烷醇类：SPF 中鉴定出 1 种异黄烷醇，为 4',7-二羟基-6-甲氧基异黄烷。

• 奥弄醇类：SPF 中含有 2 种奥弄醇，其中仅化合物 46 存在于 SPB 中。化合物 19 和 46 分别鉴定为马索普素 6 - 葡萄糖苷和 2,3',6-三羟基-4'-甲氧基苄基香豆满酮。

• 2 - 芳基苯并呋喃类黄酮：SPB 中含有 2 种该类化合物，分别为双桑色素和 ω- 羟基桑色素 N。

3.3.2.2 酚酸类化合物

SPF 和 SPB 中共鉴定出 10 种酚酸类化合物，包括 5 种羟基肉桂酸类、3 种羟基苯甲酸类和 2 种其他酚酸类。

• 羟基肉桂酸类及其衍生物：SPF 中鉴定出 5 种，分别为芥子酸、绿原酸、阿魏酸（Sun 等人，2022；Suo 等人，2022）、1-O-2'- 羟基-4'-甲氧基肉桂酰-β-D -葡萄糖和 5'-((Z)-阿魏酰基) 3-(2'-甲基阿拉伯糖基木糖)。

• 羟基苯甲酸类及其衍生物：SPB 中含有 3 种，其中化合物 51 和 52 也存在于 SPF 中。化合物 45、51 和 52 分别鉴定为梅勒多酮 A、2-羟基-4-三氟甲基苯甲酸和抗生素 SB 202742。

• 其他酚酸类：SPB 中含有香草乳酸（Li 等人，2017），SPF 中含有 3,4-二咖啡酰奎宁酸甲酯。

3.3.2.3 羟基香豆素及其衍生物

SPF 中含有 2 种，其中化合物 47 也存在于 SPB 中。化合物 6（保留时间 2.358 min，m/z 161.0246 [M-H]⁻）鉴定为 7-羟基香豆素（Wang、Liu 等人，2023）；化合物 47 鉴定为亮菌甲素。

3.3.2.4 二苯乙烯类

SPF 和 SPB 中均含有 1 种二苯乙烯类化合物，为（Z）-白藜芦醇 3,4'-二葡萄糖苷（Ismail 等人，2023）。

3.3.2.5 木脂素类

SPF 中鉴定出 1 种木脂素类化合物，为（8R,8'R）-开环异落叶松脂素 9-葡萄糖苷。

3.3.2.6 单宁类

SPF 和 SPB 中均含有 1 种单宁类化合物，为二没食子酸内酯（Ali 等人，2022）。

3.3.2.7 酚苷类

SPF 中鉴定出 3 种酚苷类化合物，分别为根皮素异丁酸苯酮 2-葡萄糖苷、2-羟基苯甲醛 O-[木糖基 -(1→6)-葡萄糖苷] 和顺式对香豆酸 4-[芹菜糖基 -(1→2)-葡萄糖苷]。

3.3.2.8 酚醇类及其衍生物

SPF 中含有 5-(3',4'-二羟基苯基)-γ- 戊内酯，SPB 中含有酪醇（Gentile & Uccella，2014）。

3.3.2.9 其他酚类化合物

除上述类别外，还鉴定出 4 种其他酚类化合物。SPF 和 SPB 中均含有陀螺花青素、6,7-二氢-4-(羟甲基)-2-(对羟苯乙基)-7-甲基-5H-2-吡啶鎓和 2-丁基-4-甲基苯酚；SPB 中还含有 [10]- 姜二酮。

3.4 SPF 和 SPB 的体外抗氧化活性

采用 ABTS⁺和 DPPH 自由基清除率对不同浓度（10-100 μg/mL）样品的体外抗氧化活性进行初步评估。如图 5 所示，在 10-100 μg/mL 浓度范围内，Vc、SPF 和 SPB 的 ABTS⁺自由基清除率分别为 40.9%-100%、18.4%-75.8% 和 30.1%-92.8%；对应的 DPPH 自由基清除率分别为 64.2%-96.7%、38.3%-62.9% 和 42.5%-90.1%。结果表明，抗氧化活性呈浓度依赖性，相同浓度下 SPB 的抗氧化活性总体优于 SPF，这可能与两者的酚类成分差异有关。SPB 具有更高的 TPC 和 TTC，而抗氧化能力与 TPC 和 TTC 的相关性强于 TFC 和 TPAC（Amira 等人，2012；Teterovska 等人，2023；Xu 等人，2016）。

图 5 游离多酚（SPF）与结合态多酚（SPB）对（A）ABTS⁺自由基清除率、（B）DPPH 自由基清除率的影响注：不同字母表示组间经单因素方差分析（One-way ANOVA）比较存在显著差异（p < 0.05）。

总体而言，SPB 的体外抗氧化活性优于 SPF。由于生化反应体系的复杂性，单纯的体外方法难以客观评估化合物的抗氧化活性，因此需要进一步通过体内实验进行更全面的阐释。

3.5 SPF 和 SPB 的体内抗氧化活性

秀丽隐杆线虫具有体型小、透明、无毒、雌雄同体、生长周期短、易培养观察等特点，已成为常用的模式生物。研究表明，秀丽隐杆线虫中约 60%-80% 的基因与人类同源，且具有与人类相似的抗氧化系统（Zhu 等人，2022），是研究人体抗氧化功能的理想模式生物。本研究通过评估氧化应激下秀丽隐杆线虫的存活率、ROS 水平和抗氧化酶活性，考察 SPF 和 SPB 的体内抗氧化活性。

3.5.1 SPF 和 SPB 对氧化应激下秀丽隐杆线虫存活率的影响

百草枯应激下秀丽隐杆线虫的存活率结果（图 6A）显示，样品处理可在不同处理时间下提高秀丽隐杆线虫的存活率。SPF-1（100 μg/mL）、SPF-2（200 μg/mL）、SPB-1（100 μg/mL）和 SPB-2（200 μg/mL）处理组的最大存活时间分别为 11、12、12 和 12 h，均高于阴性对照组（NC 组，9 h）；平均存活时间分别为 6.6±0.2、7.4±0.5、6.8±0.3 和 7.5±0.5 h，显著高于 NC 组（5.7±0.2 h）（p<0.05），分别提高了 15.9%、29.2%、18.5% 和 30.8%。此外，SPF-2 和 SPB-2 组的平均存活时间与阳性对照组（PC 组，7.5±0.5 h）无显著差异（p>0.05）。

图 6 游离多酚（SPF）与结合态多酚（SPB）对（A）秀丽隐杆线虫存活率、（B）活性氧（ROS）相对荧光强度、（C）氧化应激下 ROS 水平、（D）过氧化氢酶（CAT）活性、（E）超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响注：UT 为未处理组，NC 为阴性对照组，PC 为阳性对照组，SPF-1 为 100 μg/mL SPF 处理组，SPF-2 为 200 μg/mL SPF 处理组，SPB-1 为 100 μg/mL SPB 处理组，SPB-2 为 200 μg/mL SPB 处理组；不同字母表示组间经单因素方差分析（One-way ANOVA）比较存在显著差异（p < 0.05）。

3.5.2 SPF 和 SPB 对秀丽隐杆线虫 ROS 水平的影响

ROS 是具有细胞内信使功能的自由基。通常，机体在受到外界应激时会产生大量 ROS，导致氧化系统失衡，进而引发氧化损伤（Phull 等人，2018）。大量证据表明，植物多酚可作为电子供体或氢原子供体，中断氧化反应或清除 ROS（Luo 等人，2019）。如图 6B-C 所示，百草枯处理后，线虫体内 ROS 水平显著升高（p<0.05），表明线虫成功受到氧化应激；Vc 处理后，线虫体内 ROS 水平恢复至正常状态。与 NC 组相比，所有样品处理组的线虫 ROS 水平均显著降低（p<0.05），表明不同浓度的 SPF 和 SPB 均能调节 ROS 水平。其中，SPF-2 和 SPB-2 组的线虫 ROS 水平分别降至 25.9±1.4 和 22.7±0.8，与 PC 组（23.7±1.2）无显著差异（p>0.05）；且 SPB-2 组的效果更为显著，与未处理组（UT 组，22.0±0.5）无显著差异（p>0.05）。

3.5.3 SPF 和 SPB 对秀丽隐杆线虫 CAT 和 SOD 活性的影响

抗氧化酶是生物体抵御氧化损伤的重要防御机制，过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）在生物体抗氧化系统中具有重要作用。其中，SOD 催化超氧阴离子转化为过氧化氢和氧气，CAT 催化过氧化氢分解为水和氧气，从而保护细胞免受氧化损伤（Wu 等人，2022）。如图 6D-E 所示，SPF 和 SPB 均能提高线虫体内的抗氧化酶活性。百草枯处理后，线虫体内 CAT 和 SOD 活性显著降低（p<0.05），表明线虫成功受到氧化应激。CAT 活性测定结果（图 6D）显示，SPF-1 组的 CAT 活性较 NC 组有所升高，但无统计学意义（p>0.05）；SPF-2、SPB-1 和 SPB-2 处理组的线虫 CAT 活性显著升高（p<0.05），分别为 12.7±0.4、11.6±1.2 和 12.7±0.9 U/mgprot，与 PC 组（13.1±0.7 U/mgprot）无显著差异（p>0.05）。SOD 活性测定结果（图 6E）显示，所有样品处理组的线虫 SOD 活性均显著高于 NC 组（p<0.05）；其中 SPB-2 组的线虫 SOD 活性为 73.6±1.2 U/mgprot，显著高于 PC 组（70.9±1.5 U/mgprot）（p<0.05）。

体外和体内研究结果表明，甘蔗梢多酚具有良好的抗氧化活性，高浓度下活性可与 Vc 媲美，且 SPB 的活性优于 SPF。酚类化合物的抗氧化活性与其酚羟基性质和取代基密切相关。单宁类化合物具有高浓度的邻位羟基，苯环上的电子分布对称，能稳定酚氧自由基的形成，从而增强抗氧化活性（Wang 等人，2019）。此外，高分子量多酚可能因具有多个活性位点而表现出更强的活性。因此，SPB 可能是一种比游离多酚更具潜力的抗氧化剂。

4 结论

本研究从甘蔗梢中提取游离多酚和结合态多酚，深入分析了两者的酚类成分和抗氧化活性，重点关注其在含量、组成和活性方面的差异。研究发现，甘蔗梢中结合态多酚含量显著高于游离多酚；通过 UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 共鉴定出 56 种酚类化合物，其中 SPF 中含有 44 种（主要为黄酮类和酚酸类），SPB 中含有 31 种，且 SPB 的总酚含量和总单宁含量高于 SPF。此外，SPB 的抗氧化活性优于 SPF，不仅是强效的体外自由基清除剂，还是体内氧化损伤的有效预防剂，这一特性归因于其更高的总酚含量和总单宁含量。本研究发现了一种以往被忽视的高含量、高活性抗氧化剂——甘蔗梢结合态多酚，补充了甘蔗梢多酚的理论研究，为甘蔗梢在功能食品领域的应用提供了理论指导，有助于提升其经济潜力。然而，多酚与抗氧化活性之间的明确关系仍需进一步阐明，未来研究可采用主成分分析、皮尔逊相关系数等多元统计技术进行更全面的评估。此外，深入研究甘蔗梢结合态多酚在降血糖、降血脂、抗癌等其他方面的活性，可为甘蔗副产品的开发利用提供更有力的理论支持。