摘要

清麴酱是韩国传统发酵豆制品，具有潜在健康益处，除作为食材外，也常以片剂形式食用。目前通过血液和粪便检测评估清麴酱食用前后各类健康指标变化的临床试验较少。本研究分析了高剂量（n=19）、低剂量（n=20）有益菌传统清麴酱片剂及市售清麴酱片剂（n=20）食用前后受试者的症状与血液学变化，测定了抗肥胖功效及身体成分改变，并比较了粪便中微生物与短链脂肪酸的变化。结果显示，食用清麴酱前后，肥胖及炎症相关指标无显著变化；与肥胖相关的厚壁菌门 / 拟杆菌门（F/B）比值在三组中均有所下降，但无统计学意义；清麴酱中含有多种生物胺（BAs），但未对受试者的症状及血液学指标产生不良影响。这项随机双盲临床试验表明，清麴酱生产过程中产生的生物胺无有害作用。未来需进一步研究其抗肥胖功效及粪便中微生物组与短链脂肪酸的变化。

关键词

芽孢杆菌属；清麴酱；肥胖；短链脂肪酸；生物胺

1. 引言

大豆营养丰富，富含多种维生素和矿物质，在韩国等亚洲国家是日常生活中重要的膳食营养来源。清麴酱是韩国传统发酵豆制品，含有必需氨基酸、脂肪酸、有机酸、矿物质和维生素等营养成分，是极具营养价值的功能性食品，与酱油、豆瓣酱、辣椒酱同属传统酱料类。清麴酱的发酵过程依赖微生物作用，常用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌株单独发酵或混合发酵。发酵过程中，芽孢杆菌属菌株分解大豆中的蛋白质及其他营养物质，产生包括黏性黏液状物质在内的多种化合物，这类黏液状物质是包含果聚糖和聚谷氨酸的复杂混合物。但发酵过程中也可能产生生物胺（BAs）等有害物质。生物胺是醛类和酮类通过胺化反应与转氨基反应生成的低分子量化合物，分为脂肪族（腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、精胺、亚精胺（SPD））、芳香族（酪胺（TYR）、苯乙胺）和杂环类（组胺（HIS）、色胺）[8]。生物胺是维持人体生理功能的必需物质，体内通过代谢过程维持微量平衡，但食品生产过程中产生的生物胺可能对人体产生影响。尤其在大豆、牛奶等富含氨基酸和蛋白质的食品中，发酵过程可能产生超过人体消化极限的生物胺。这类生物胺在清麴酱等多种发酵食品中持续被检出，可能导致人体神经和血管系统异常：组胺可引发食物中毒，部分生物胺可转化为 N - 亚硝胺等致癌物；过量摄入组胺会降低血压并引发过敏，酪胺会升高血压并导致头痛，尸胺和腐胺在肠道内可生成亚硝胺、亚硝基哌啶、亚硝基吡咯烷等强致癌物。鉴于此风险，欧盟在 2008-2011 年开展了针对奶酪、葡萄酒、香肠等欧洲传统发酵食品的生物胺减排项目。全球范围内已对肉类、鱼类、乳制品、葡萄酒、巧克力、蔬菜、水果、坚果等多种食品中的生物胺含量进行了研究，并针对发酵食品、水产品、葡萄酒制定了组胺和酪胺的耐受标准。在清麴酱发酵中，枯草芽孢杆菌等微生物作用于蒸煮后的大豆，使组织软化；发酵产生的黏液是 γ- 聚谷氨酸与果糖聚合物果聚糖的混合生物聚合物。研究表明，清麴酱中的这些物质可抑制脂肪细胞分化和脂肪生成，在肥胖及代谢性疾病治疗中具有应用价值。此前针对清麴酱的临床试验显示，其可降低体重和体脂、减少低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平、改善血清脂质。本临床试验首次分析了高、低剂量有效菌株传统清麴酱及市售清麴酱的生物胺含量，验证其食用安全性；探究了三类清麴酱的抗肥胖和调脂功效，并比较了食用后粪便中微生物的变化。

2. 材料与方法

2.1 研究设计

本研究为为期 8 周的随机双盲临床试验（注册号：KCT0007734）。受试者需到访研究中心 3 次，食用清麴酱 4 周后进行生命体征、副作用及用药依从性检查；首次和末次到访时评估体重、腹部脂肪计算机断层扫描（CT）、炎症标志物、脂质谱、血液检测等功效指标。试验用清麴酱片剂分为三类：高活性微生物传统清麴酱片剂（HTC）、低活性微生物传统清麴酱片剂（LTC）、市售清麴酱片剂（CC）。62 名受试者随机分为三组：HTC 组（n=19）、LTC 组（n=20）、CC 组（n=20），脱落率为 5%，最终 59 名受试者完成研究。签署知情同意书的受试者将获得筛选编号（01-62）作为身份识别码。所有受试者需遵守试验要求：仅食用试验提供的清麴酱片剂，不服用其他药物或保健食品，维持日常饮食和活动量。

2.2 生物胺分析

生物胺定量参照《韩国食品法典》（MFDS，2016）。取 1.0 mL 样品，用 0.1 mol/L 盐酸定容至 50 mL 制备供试品溶液；取 1 mL 供试品溶液置于试管中，加入 0.1 mL 内标溶液、饱和碳酸钠溶液及 0.8 mL 1% 丹磺酰氯溶液，充分混匀后密封，45℃加热 1 小时进行衍生化。向衍生化后的标准溶液中加入 0.5 mL 10% 脯氨酸溶液和 5 mL 乙醚溶液，收集上清液并氮气浓缩，用 1 mL 乙腈溶解后经 0.45 μm 注射器过滤器过滤，采用高效液相色谱（HPLC，Ultimate 3000，赛默飞世尔科技有限公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行分析。

2.3 受试者

招募体重指数（BMI）≥25 kg/m²、年龄 19-70 岁的肥胖志愿者，随机分为三组。排除标准包括：近 3 个月体重变化 > 10%；患有心律失常、心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病或使用心脏起搏器；对试验产品任何成分过敏或过敏体质；患有克罗恩病等结肠疾病或有胃肠手术史（如阑尾切除术、肠切除术）；近 2 个月参与其他临床试验；肝功能不全或急慢性肾病；近 2 个月使用抗精神病药物；研究者评估实验室检查异常；精神状态异常；有酒精或药物滥用史；妊娠或哺乳期。本研究方案经圆光大学医院伦理委员会批准（伦理号：WKUH 2022-05-025）。受试者需填写饮食日记，准确记录所有食用食物；到访时完成基于世界卫生组织全球体力活动问卷（GPAQ）的体力活动调查。受试者每日服用 1 次 3 克清麴酱片剂（含 3 克发酵大豆）。

2.4 安全性评估

受试者需接受心电图、尿常规、血常规、血生化等筛查试验，检测指标包括白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、血小板计数、总蛋白、白蛋白、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、肌酐。每次到访时，受试者休息 10 分钟后测量脉搏和血压，并报告食用清麴酱片剂期间出现的任何症状。

2.5 肥胖评估指标

受试者取仰卧位，采用 CT（HiSpeed CT/e；通用电气公司，美国马萨诸塞州波士顿）测量腹部脂肪，计算总腹部脂肪面积、皮下脂肪面积和内脏脂肪面积（单位：mm²）。采血前受试者需空腹 > 12 小时，采用日立 7600 自动分析仪（日立公司，日本东京）检测总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、非高密度脂蛋白胆固醇（NonHDL-C）、ALT、AST、γ- 谷氨酰转移酶（GGT）、BUN、肌酐、血糖、胰岛素、超敏 C 反应蛋白，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和定量胰岛素敏感性检查指数（QUICKI）。

2.6 炎症标志物评估

检测血清炎症标志物白细胞介素（IL）-6 和触珠蛋白，以评估食用清麴酱片剂前后炎症状态的改善情况。血液采集后静置 30 分钟凝血，3000 转 / 分钟离心 10 分钟，分离上清液置于微量离心管中，-70℃保存，由委托机构（韩国京畿道龙仁市器兴区兴德 1 路 13 号 SCL Healthcare 有限公司）完成检测。

2.7 肠道微生物群变化评估

为分析肠道微生物群变化，受试者在首次到访和 8 周后进行粪便检测。使用 MICROBE & ME 粪便采集试剂盒（Macrogen 公司，韩国首尔）收集 1 克以上粪便，冷冻后提交。

2.8 试验用清麴酱片剂制备

传统清麴酱以稻草为发酵菌种载体：大豆经清洗、10℃浸泡 15 小时、121℃蒸煮 40-45 分钟、50℃冷却后接种芽孢杆菌属菌株，在 35-40℃、湿度 80% 的环境中发酵 24-72 小时，加入盐、红辣椒粉等辅料后干燥，制成炖煮用清麴酱（传统清麴酱生产流程见图 1）。临床试验用清麴酱片剂的制备流程：将清麴酱冷冻干燥后粉碎。

2.9 统计分析

所有统计分析采用 PASW Statistics 23（原 SPSS Statistics）（SPSS 23.0 版；IBM SPSS 公司，美国伊利诺伊州芝加哥）进行。计量资料以均数 ± 标准误表示，分类资料以百分比（%）表示，P<0.05 为差异有统计学意义。样本量设定：α=0.05，统计效能 80%，考虑 20% 脱落率确定每组样本量。功效指标采用符合方案集分析，安全性指标采用意向性治疗集分析。组间分类变量基线差异采用卡方检验，8 周干预前后组内差异采用配对 t 检验，连续结局变量重复测量数据采用线性混合效应模型分析。24 小时膳食摄入量数据由专业人员采用 Can-Pro 3.0 软件（韩国营养学会，韩国首尔）分析。

3. 结果

3.1 受试者情况

共招募 62 名受试者，1 名不符合纳入标准，2 名拒绝参与，剩余 59 名随机分为 HTC 组、LTC 组和 CC 组，均完成 8 周研究。最终纳入分析的 59 名受试者中，HTC 组 19 人、LTC 组 20 人、CC 组 20 人。所有受试者完成研究后均未报告不良事件。

3.2 人体测量学参数

三组受试者的年龄、性别、体重、身高、饮酒史、吸烟史、初始体重、初始 BMI 等基线特征无统计学差异（P>0.05）。膳食摄入量调查显示，组内及组间热量摄入无显著变化（P>0.05）；体力活动调查显示，组内及组间任务代谢当量无显著差异（P>0.05）。

3.3 清麴酱中的生物胺含量

对三类清麴酱产品中的腐胺、尸胺、组胺、血清素、酪胺、亚精胺、去甲肾上腺素、多巴胺、精胺 9 种生物胺进行检测，结果显示所有样品中均检出尸胺、组胺和亚精胺，其余生物胺未检出；不同样品中三种生物胺的含量存在差异，但均稳定存在。

3.4 安全性评估

血液检测显示，食用清麴酱片剂后，三组受试者的肝脏炎症指标、肾功能及血常规均未升高；其中 CC 组的 γ- 谷氨酰转移酶（GGT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）水平有所下降。所有组受试者食用清麴酱片剂后均未报告异常症状。

3.5 对肥胖和炎症的影响

清麴酱未显示出抗肥胖功效，相反 LTC 组食用后体脂量和体脂率有所上升；所有组腹部脂肪 CT 检测结果无变化。清麴酱对总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、非高密度脂蛋白胆固醇无显著影响，对血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、定量胰岛素敏感性检查指数也无明显作用。血清炎症标志物超敏 C 反应蛋白、白细胞介素 - 6、触珠蛋白在食用清麴酱后均无显著变化。

3.6 粪便微生物群与短链脂肪酸分析

三组受试者食用清麴酱片剂后，与肥胖相关的厚壁菌门 / 拟杆菌门（F/B）比值均有所下降，但无统计学意义。粪便样本分析显示，三组食用后有益菌（乳酸菌属、双歧杆菌属、乳酸乳球菌、屎肠球菌、拟杆菌属等）和有害菌（产气荚膜梭菌、埃格特拟杆菌、粪便萨特氏菌、扭链瘤胃球菌、粪便副拟杆菌、迪氏副拟杆菌等）的数量均无统计学差异。短链脂肪酸检测显示，仅 HTC 组粪便中乙酸、丙酸、丁酸的总浓度有所下降，但差异无统计学意义。

4. 讨论

清麴酱是韩国传统食品，由蒸煮大豆和稻草发酵制成，含有异黄酮、植酸、皂苷、胰蛋白酶抑制剂、生育酚、不饱和脂肪酸、膳食纤维、低聚糖、抗氧化剂、溶栓酶等多种生物活性物质，这些成分使其具有潜在健康益处。生物胺是大豆蛋白发酵过程（清麴酱等发酵豆制品的主要原料）产生的物质，可影响细胞生长和增殖，但也可能引发皮肤炎症、头痛、腹痛等不良反应，且可能通过肠道微生物代谢转化为致癌物；此外，生物胺还可能刺激血管和神经，导致部分人群不适。因此，食品中生物胺含量不仅是食品安全的指标，也是评估生产规范的质量标准。全球范围内，多种发酵食品的生产是复杂的生化过程，涉及多种微生物，这些微生物在生物胺积累中起关键作用 [19,20]。本研究检测了传统清麴酱及发酵食品中的生物胺含量，并通过分析高、低剂量有效菌株传统清麴酱的生物胺含量，验证了其人体食用安全性。食品微生物通常通过分泌氨基酸脱羧酶产生生物胺，因此研究者致力于表征发酵食品的微生物群并评估其生物胺生成能力，以深入了解食品中生物胺的积累机制。控制生物胺含量是保障清麴酱等热门传统发酵食品质量和安全的关键，因此有必要通过现有发酵食品生产工艺检测生物胺含量，验证其人体食用的临床安全性。尽管清麴酱等传统发酵食品被广泛食用，但目前尚无因这类食品中生物胺导致疾病或死亡的报告，同时越来越多研究证实了这些传统发酵食品的潜在健康益处。韩国一项研究检测了超市和市场上 37 种清麴酱产品中的 8 种生物胺和 18 种无机成分，结果显示酪胺含量最高（113.7 mg/kg），且不同样品间浓度差异显著。韩国清麴酱的种类繁多，风味和营养成分差异明显，这是由于各地区使用的大豆品种和发酵工艺不同，且尚未实现标准化和系统化。因此，不同类型清麴酱的生物胺含量因生产影响因素不同而存在差异，直接比较无实际意义，但仍需研究生物胺对人体的影响。韩国已有多项研究分析了各类清麴酱产品中的 8 种生物胺（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺），但不同研究结果不一致，同一研究中不同清麴酱产品的生物胺含量也存在差异。在检测的生物胺中，腐胺、尸胺、组胺、酪胺、苯乙胺与健康风险相关，其他胺类尚未见风险相关报告。动物实验显示，清麴酱具有多种代谢益处，包括抗肥胖、抗糖尿病、抗炎和神经保护作用：在饮食诱导肥胖动物模型中，清麴酱可降低体重、附睾脂肪积累、血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇；在小鼠模型中，补充清麴酱可显著降低血糖和糖化血红蛋白水平，改善胰岛素抵抗。但本研究显示，食用清麴酱片剂后，脂质谱、血糖、胰岛素指数、腹部内脏脂肪 CT 结果、身体成分分析等所有肥胖相关指标均未改善；与动物实验中清麴酱的抗炎功效不一致，本研究中血清炎症标志物超敏 C 反应蛋白、触珠蛋白、白细胞介素 - 6 也未出现改善。厚壁菌门是肠道微生物群的主要组成部分，厚壁菌门减少、拟杆菌门增加与体重减轻相关。厚壁菌门主要包括芽孢杆菌属、梭菌属、乳球菌属、链球菌属等，其余多为嗜酸拟杆菌、迪氏拟杆菌、脆弱拟杆菌等。本研究为简化复杂的微生物组成分析，仅检测了肠道内厚壁菌门和拟杆菌门两大主要菌门。厚壁菌门 / 拟杆菌门（F/B）比值与体内稳态相关，其变化可能引发多种病理状态，例如比值升高与肥胖相关。本研究中，三组受试者食用清麴酱片剂后 F/B 比值均有所下降，但无统计学意义。日本肥胖人群的粪便样本分析显示，F/B 比值存在显著差异：瘦体重受试者的厚壁菌门占比为 37.0±9.1%，肥胖受试者为 40.8±15.0%；瘦体重受试者的拟杆菌门占比为 44.0±9.8%，肥胖受试者为 37.0±14.0%。针对 61 名乌克兰成年人的研究显示，F/B 比值与 BMI 相关，F/B 比值≥1 的人群超重风险高于比值 < 1 的人群。卡塔尔的研究显示，37 名肥胖患者和 36 名非肥胖患者的 F/B 比值分别为 2.25±1.83 和 1.76±0.58。哈萨克斯坦和比利时的研究显示，学龄儿童中肥胖组的 F/B 比值高于对照组。但也有研究得出相反结论：韩国青少年（13-16 岁）中，肥胖患者（BMI≥30 kg/m²）与非肥胖患者（BMI<25 kg/m²）的粪便 F/B 比值无统计学差异（非肥胖组 0.50±0.53，肥胖组 0.56±0.86）。F/B 比值是衡量肠道微生物群结构的常用指标，在门水平研究中，超重 / 肥胖成年人的 F/B 比值升高，表现为厚壁菌门丰度增加、拟杆菌门丰度降低。但在代谢综合征患者（如超重 / 肥胖）尤其是儿童的肠道中，厚壁菌门组成的异质性高于拟杆菌门。例如，梭菌属（厚壁菌门）与儿童 BMI 呈正相关，在年轻人中作用更显著；肠易激综合征患者的梭菌属、多雷亚菌属、瘤胃球菌属（均为厚壁菌门）丰度也会升高。本研究存在一定局限性：首先，尽管已要求受试者保持饮食和运动习惯不变，但无法完全控制其饮食和活动量；其次，样本量较小，研究结果可能无法推广至更广泛人群。

5. 结论

本研究首次通过临床试验同时验证了食用清麴酱后的安全性、抗肥胖相关指标、炎症指标、微生物群及粪便短链脂肪酸等多项指标变化。尽管各项指标无统计学意义，但研究结果为未来清麴酱相关临床试验提供了参考。结果显示，清麴酱无明显抗肥胖功效；此外，尽管无统计学意义，但三组受试者的 F/B 比值均有所下降，这一发现值得进一步研究。

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