摘要

康普茶以其高酚类化合物含量及其相关生物活性而闻名。本研究评估了标准化绿茶康普茶的酚类化合物谱，并通过体外实验及秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）体内模型，探究了其三种浓度（25、125 和 250μL・mL⁻¹）的抗氧化活性。采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联质谱（HPLC-DAD-MS/MS）分析鉴定出 35 种酚类化合物，重点对（表）没食子儿茶素没食子酸酯及其衍生物进行了定量分析。三种浓度的康普茶均未表现出体内毒性，且能减少过氧化氢（H₂O₂）诱导的活性物质生成及脂质过氧化水平。125μL・mL⁻¹ 和 250μL・mL⁻¹ 浓度组可提高秀丽隐杆线虫体内超氧化物歧化酶（SOD）的荧光强度，但所有浓度的康普茶均未能缓解 H₂O₂诱导的秀丽隐杆线虫存活能力下降。研究结果表明，每日饮用 600mL 本研究定制的康普茶可能是兼具抗氧化保护作用且无毒性的可行摄入量。

关键词

功能性饮料；绿茶；康普茶毒性；氧化应激；生物活性化合物

1 引言

功能性健康食品的消费量显著增长，其中发酵产品备受关注。康普茶是通过茶（Camellia sinensis）浸出液或其他植物提取物，添加糖类后，经微生物活性细菌与酵母共生菌群（SCOBY）发酵制成的饮品。其在全球范围内广受欢迎，主要得益于其宣称的多种健康益处，如具有抗菌、抗氧化、抗肥胖、抗炎活性，还能刺激免疫系统和中枢神经系统等（Abaci 等，2022；Ivanišová 等，2020；Moreira 等，2022；Mulyani 等，2019）。

康普茶富含酚类化合物（PC），其中儿茶素和黄酮类化合物（茶黄素和黄烷醇）含量最为丰富（Cardoso 等，2020；Yang 等，2022）。酚类化合物可作为外源性抗氧化剂，与体内谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等内源性防御系统协同作用，中和活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等活性物质（Silva 等，2021）。活性氧和活性氮水平升高与糖尿病、癌症、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展相关（Massoud 等，2022）。因此，康普茶中的酚类化合物可对抗氧化应激，减少蛋白质、脂质、DNA 等生物大分子的损伤，进而延缓多种疾病的发生与进展（Ramírez-Moreno 等，2022；Rudrapal 等，2022）。

康普茶等发酵食品的最终成分差异较大，其酚类化合物含量受多种因素影响，如发酵起始菌群的数量与组成、茶和糖的种类，以及温度、pH 值、发酵时间等工艺参数（de Miranda 等，2022；Kim 等，2023；Shi 等，2023）。由于康普茶生产缺乏标准化，难以制定统一的每日摄入量建议。尽管康普茶被认为是天然健康食品，但已有研究表明过量摄入（每日 > 360mL）可能引发毒性反应，如过敏、胃肠道问题甚至代谢性酸中毒（Batista 等，2022；Hartmann 等，2000；Sfinivasan 等，1997）。美国疾病控制与预防中心（CDC）指出，每日饮用不超过 120mL 康普茶对人体健康无风险（Jayabalan 等，2014；Leal 等，2018）。

因此，为安全验证康普茶的健康益处，需开展更多基于啮齿动物、兔子等模型的体外和体内研究。Murugesan 等（2009）以雄性白化大鼠为实验模型，发现每日给予 2.5mL・kg⁻¹ 体重的康普茶，持续 30 天可逆转四氯化碳（CCl₄）诱导的肝毒性。Silva 等（2021）报道，每毫克体重 50⁻¹ 的绿茶康普茶（10pL）对巴西副球孢子菌具有抗真菌活性，且对大蜡螟幼虫无毒性。然而，这些研究未使用微生物组成明确的标准化饮品，因此其有益效果难以推广至其他康普茶产品。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为替代生物模型，已被广泛应用于实验室研究，可减少哺乳动物的使用（Wang、Guo 等，2022）。该线虫具有易培养、生命周期短、代谢相对简单等特点（Kaletta & Hengartner，2006），且约 70% 的基因和信号通路与哺乳动物同源，能够有效模拟人体分子水平的抗氧化防御机制（Hunt，2017；Schmidt 等，2020）。秀丽隐杆线虫常被用于评估天然产物中生物活性化合物的毒性与功能（Li 等，2023），是评价新型食品生物活性与毒性的理想体内模型。

基于上述背景，本研究旨在通过体外实验及秀丽隐杆线虫体内模型，评估由明确起始菌群制备的标准化绿茶康普茶的酚类化合物谱及抗氧化潜力。

2 材料与方法

2.1 试剂

分析纯乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸，以及线虫生长培养基（NGM）相关试剂购自巴西圣保罗 Neon© 公司；抗坏血酸、盐酸（HCl）、硫代巴比妥酸（TBA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化铁（FeCl₃）、乙醇和过氧化氢（H₂O₂）购自巴西圣保罗 Dinâmica Química Contemporânea® 公司；2 - 脱氧 - D - 核糖、谷胱甘肽（GSH）、2'，7'- 二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）、5,5'- 二硫代双（2 - 硝基苯甲酸）（DTNB）购自美国密苏里州圣路易斯 Sigma-Aldrich 公司；高效液相色谱（HPLC）级乙腈和甲酸分别购自美国新泽西州菲利普斯堡 J. T. Baker 公司和德国达姆施塔特 Merck 公司。17 种酚类化合物标准品（没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、原花青素 B1、儿茶素、咖啡酸、没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素 - 3 - 葡萄糖苷、茶没食子素、原花青素 C1、原花青素 A2、杨梅素、山奈酚、表儿茶素、芦丁、对香豆酸、槲皮素）购自美国 Sigma-Aldrich 公司（纯度≥90%）。

2.2 定制绿茶康普茶的制备

康普茶的制备遵循本研究团队已建立的方案（Fabricio 等，2023）。简要步骤如下：向沸蒸馏水中加入 8g・L⁻¹ 的有机绿茶（巴西圣卡塔琳娜州 Vemat 公司），保持 100℃±5℃浸泡 10 分钟；经 0.22μm 滤膜过滤后，向茶浸出液中添加 50g・L⁻¹ 的有机德梅拉拉糖（巴西圣保罗州 Native 公司）；冷却后，加入定制微生物起始菌群 [食糖 Komagataeibacter 菌（10⁷CFU・mL⁻¹）、异常布勒弹酵母（10⁵CFU・mL⁻¹）、马克斯克鲁维酵母（10⁶CFU・mL⁻¹）] 启动发酵，所选微生物基于前期研究确定（Fabricio 等，2022，2023）。

选择马克斯克鲁维酵母的原因在于其具有高蔗糖水解能力、快速生长速率及潜在益生菌特性（如刺激免疫系统、肠道定植能力）（Maccaferri 等，2012；Tabanelli 等，2016）。该定制微生物菌群在康普茶生产中具有多项生物技术优势：工艺稳定性高，减少批次间差异，实现发酵过程可重复性；发酵时间从 7 天缩短至 2 天；益生菌菌株在 60 天保质期内保持活性（Fabricio 等，2023）。

康普茶发酵在 28℃的玻璃烧杯中进行，持续 48 小时，烧杯用无菌纱布覆盖以提供有氧环境（Fabricio 等，2023）。发酵完成后，将康普茶装入无菌密封玻璃瓶中，在 28℃下继续进行 48 天自然碳酸化过程，酵母在此期间将糖类转化为二氧化碳（Fabricio 等，2022）。最终产品的酒精含量（0.61% v・v⁻¹）和乙酸含量（1.8g・L⁻¹）均符合巴西相关法规限值（巴西农业、畜牧和食品供应部，2019）。将饮品分装至 2mL 离心管中，于 - 20℃冷冻保存，以备后续分析。

2.3 康普茶酚类化合物谱的测定

采用高效液相色谱 - 二极管阵列检测器 - 串联质谱（HPLC-DAD-MS/MS）对康普茶中的酚类化合物进行分离、鉴定和定量，方法基于 Rodrigues 等（2013）的研究并稍作修改。使用 Shimadzu 高效液相色谱仪（日本京都），串联 Bruker Daltonics 四极杆飞行时间质谱仪（德国不来梅，型号 micrOTOF-QIII）；色谱柱为 C18 Synergi Hydro-RP 柱（4μm，250mm×4.6mm，美国加利福尼亚州托伦斯 Phenomenex 公司），柱温 35℃，流速 0.5mL・min⁻¹；流动相由 Milli-Q 水 / 甲酸（溶剂 A）和乙腈 / 甲酸（溶剂 B）组成，梯度洗脱程序为 [95:5；49.9:50.1；1:99；95:5（v・v⁻¹）]；紫外 - 可见光谱检测范围为 200-800nm，色谱图在 280、320 和 520nm 附近进行处理；质谱扫描范围为 m/z 50-2000，电离模式为电喷雾电离（ESI）正离子模式和负离子模式，毛细管电压分别为 3000V（正离子）和 4000V（负离子），端板偏移 - 500V，干燥气（N₂）温度 310℃，流速 8L・min⁻¹，雾化气压 4bar。

通过手动解析保留时间、精确质量、柱洗脱顺序、紫外 - 可见吸收光谱及化合物碎片结构特征，并与相同条件下分析的标准品及文献数据对比，对康普茶中的酚类化合物进行注释。采用 HPLC-DAD 在相同条件下对酚类化合物进行定量，基于 17 种标准品绘制校准曲线（9 个浓度点），并通过标准误差验证校准曲线的线性关系（表 1）。

2.4 康普茶抗氧化潜力的评估

选取 25、125 和 250μL・mL⁻¹ 三种浓度的康普茶进行体外和体内实验。剂量选择依据美国 CDC 建议（每日饮用不超过 120mL 康普茶对人体安全），该摄入量对应秀丽隐杆线虫模型的剂量为 25μL・mL⁻¹，以此为基础分别外推 5 倍和 10 倍，得到 125μL・mL⁻¹ 和 250μL・mL⁻¹ 浓度（Pauline，2001）。

2.4.1 体外分析

采用谷胱甘肽（GSH）实验评估康普茶抑制 H₂O₂诱导的 GSH 氧化及巯基减少的能力（Ellman，1959）。将不同浓度的康普茶（25、125、250μL・mL⁻¹）与 1mM 磷酸钾缓冲液（TFK）、水、300mM H₂O₂和 6mM GSH 在试管中混合，孵育 1 小时。孵育结束后，加入 10mM DTNB，通过分光光度计（美国加利福尼亚州圣何塞 Molecular Devices 公司，SpectraMax Plus 384 酶标仪）在 412nm 处测定 GSH 巯基的减少量，结果以 GSH 含量（nmol GSH・mL⁻¹ DTNB）表示（Ellman，1959）。

采用脱氧核糖实验评估康普茶清除芬顿反应产生的羟自由基（・OH）的能力（Halliwell 等，1987）。将不同浓度的康普茶与 50mM TFK、1mM EDTA、1mM FeCl₃、水、2mM 抗坏血酸、60mM 脱氧核糖和 300mM H₂O₂在试管中混合，37℃孵育 1 小时。反应结束后，向每支试管中加入 1mL 硫代巴比妥酸（TBA）和 1mL 25% HCl，在 100℃水浴中孵育 15 分钟。通过分光光度计在 532nm 处测定反应生成的橙红色 TBA 加合物的吸光度，结果以羟自由基生成率（%）表示（Halliwell 等，1987）。

2.4.2 体内分析

2.4.2.1 线虫的培养与同步化

体内实验使用秀丽隐杆线虫 N2（野生型）和荧光标记菌株（SOD：GFP CF1553（muls84）），均购自美国明尼苏达州双子城秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）。根据 Brenner 的方法（Brenner，2003），将线虫饲养在含有 10μL 大肠杆菌（E. coli）OP50（作为食物来源）的 NGM 培养基（60×10mm 培养皿）中，置于 20℃生化需氧量培养箱（巴西圣保罗州 Piracicaba Solidsteel 公司）中培养。采用漂白溶液（1% NaCl 和 0.25M NaOH）分离孕母虫胚胎，仅收集虫卵；用 M9 缓冲液（0.02M KH₂PO₄、0.04M Na₂HPO₄、0.08M NaCl、0.001M MgSO₄）洗涤虫卵后，在无大肠杆菌 OP50 的无菌 NGM 琼脂平板上孵育 12 小时（Avila 等，2012），确保所有线虫均处于 L1 幼虫期。

2.4.2.2 实验方案与分析

为评估康普茶对秀丽隐杆线虫的毒性，将 2500 条线虫在 20℃、振荡条件下，于含有生理盐水（对照组）或不同浓度康普茶（25、125、250μL・mL⁻¹）的离心管中暴露 30 分钟。暴露结束后，用 1% NaCl 缓冲液洗涤线虫，转移至接种有 10μL 大肠杆菌 OP50 的 NGM 培养基（60mm×10mm 培养皿）中。24 小时后，通过双目立体显微镜（巴西圣保罗州 Biofocus 公司，XT-3L 型号）计数存活线虫数量（Avila 等，2012）。

采用二氯荧光素（DCF）实验测定康普茶对活性物质（RS）生成的直接影响。将 1500 条线虫在相同浓度的康普茶中按上述条件处理后，洗涤并悬浮于 100μL 0.9% NaCl 溶液中，加入 DCFH-DA。通过酶标仪（美国 Perkin Elmer 公司，Enspire 2300 多功能酶标仪）在激发波长 485nm、发射波长 530nm 下，每 2 分钟检测一次荧光强度，持续 30 分钟，定量活性物质氧化 DCFH-DA 生成的荧光化合物（Charão 等，2015）。存活实验和活性物质生成实验结果均以对照组的百分比（%）表示。

随后，将线虫与不同浓度康普茶（25、125、250μL・mL⁻¹）和 300mM H₂O₂共同暴露 30 分钟（方法同上），通过测定活性物质生成、SOD 荧光强度、脂质过氧化标志物硫代巴比妥酸反应底物（TBARS）水平及存活率，评估康普茶的体内抗氧化潜力。存活率和活性物质生成实验步骤同上，但添加 300mM H₂O₂作为活性物质诱导剂；设置生理盐水对照组（无康普茶和 H₂O₂），所有结果以对照组的百分比（%）表示。

TBARS 实验使用 1500 条线虫，暴露 30 分钟并去除处理液后，将线虫转移至接种有大肠杆菌 OP50 的 NGM 培养基培养皿中，20℃孵育 48 小时。收集 L4 期幼虫，用无菌蒸馏水洗涤后，通过超声破碎仪（美国康涅狄格州纽敦 Qsonica 公司，Q700 型号）进行两次 1 分钟的裂解。取 60μL 上清液，与 60μL 0.1% 磷酸、60μL 0.6% TBA 和 60μL 0.6% SDS 缓冲液混合，100℃孵育 1 小时。通过分光光度计在 532nm 处测定脂质过氧化产物与 TBA 反应生成的橙红色化合物的吸光度。

SOD 表达实验使用1500 条荧光标记突变株（SOD：GFP CF1553（muls84）），在 20℃下与康普茶和 H₂O₂共同暴露 30 分钟。暴露结束后，洗涤线虫并加入 DCFH-DA，通过酶标仪在激发波长 485nm、发射波长 530nm 下，每 2 分钟检测一次荧光强度，持续 30 分钟，定量 SOD 表达生成的荧光化合物。

2.5 统计分析

所有分析实验均进行三次重复，数据采用 GraphPad PRISM® 10.0 软件（美国马萨诸塞州波士顿）进行单因素方差分析（ANOVA），必要时进行 Tukey 事后检验。

3 结果与讨论

3.1 康普茶的酚类化合物谱

康普茶富含抗氧化化合物，尤其是酚类化合物，但其含量受生产参数影响（Chakravorty 等，2019）。Kim 等（2023）发现，表儿茶素、咖啡因、咖啡酸和芦丁的含量取决于康普茶共生菌群（醋酸菌和不同酵母菌株）的组合；Shi 等（2023）报道，使用巴氏醋酸菌、拜氏接合酵母和汉逊德巴利酵母可提高表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的含量。因此，本研究探究了由标准化共生菌群（食糖 Komagataeibacter 菌、异常布勒弹酵母和马克斯克鲁维酵母）制备的绿茶康普茶的酚类化合物谱及其与饮品潜在益处的关联。

表 2 列出了通过 HPLC-ESI-qTOF-MS/MS 鉴定的 35 种康普茶酚类化合物，包括 12 种黄烷 - 3 - 醇类、7 种异羟肟酸类、7 种羟基苯甲酸及其衍生物，以及 9 种其他黄酮醇类。图 1 展示了康普茶的总离子流色谱图及其主要吸收峰对应的化学结构，表 3 列出了色谱峰对应的主要化合物及其定量结果。

图 1 定制绿茶康普茶中化合物的总离子流色谱图。色谱图中列出的峰代表主要化合物，峰编号与表 3 对应。

定制绿茶康普茶中含量较高的化合物（按定量降序排列）为：儿茶素和对香豆酰奎宁酸 II（峰 6）、（表）没食子儿茶素没食子酸酯 I（峰 7）、（表）没食子儿茶素 II 及其衍生物与二 - O - 没食子酰葡萄糖 I（峰 3）、（表）儿茶素没食子酸酯和金丝桃苷（峰 13）、槲皮素 - 3-O - 葡萄糖基 - 鼠李糖基 - 葡萄糖苷（峰 11）。除与（表）儿茶素没食子酸酯共洗脱的金丝桃苷和槲皮素外，康普茶中的主要酚类化合物为黄烷 - 3 - 醇及其衍生物。

儿茶素是植物主要的次级代谢产物类别，占茶叶及其浸出液中黄烷 - 3 - 醇含量的 80%-90%（Candela 等，2020）。He 等（2022）发现绿茶中主要酚类化合物浓度为：EGCG（502mg・L⁻¹）、表没食子儿茶素（EGC，315mg・L⁻¹）、表儿茶素没食子酸酯（ECG，44.3mg・L⁻¹）、表儿茶素（EC，33.6mg・L⁻¹）；Tao 等（2016）报道绿茶首次冲泡液中儿茶素总浓度为 500.1-690.4mg・L⁻¹，其中 EGCG 含量为 94.8mg・L⁻¹。本研究中，绿茶康普茶的 EGCG 总含量（保留时间 23.03 分钟的 EGCG I 和 24.21 分钟的 EGCG II 峰之和）为 82.97mg・L⁻¹，与上述研究结果相近。

值得注意的是，EGCG、EGC、ECG 和 EC 是茶叶中最重要的酚类化合物。这些儿茶素含有多个羟基，可直接清除活性物质，并通过激活转录因子和抗氧化酶阻止氧化物质形成（Candela 等，2020；Li 等，2010）。其含量决定了饮品的品质和生物活性，尤其是 EGCG（Alfke 等，2022；Oz，2017；Tao 等，2016）。EGCG 是茶叶中生物活性最强的化合物，其结构中儿茶素核 C-3 位的没食子酰基或邻苯三酚 B 环是其高活性的关键，具有抗炎、抗肥胖、降低心血管疾病风险等多种健康益处（de Oliveira Costa 等，2024；Sang 等，2007）。

在本研究的绿茶康普茶中，EGCG 的鉴定依据为负离子模式下串联质谱中出现的前体离子 m/z 457.0783 和 457.0792，以及对应的 MS² 碎片离子 169.0137、305.0660 和 169.0139、305.0669（表 2）。m/z 169 和 305 的碎片离子分别对应没食子酸的去质子化单元和（表）没食子儿茶素（Escobar-Avello 等，2019；Spinelli 等，2023），后者对应的邻苯三酚阴离子是 EGCG 生物活性及健康益处的主要贡献者。

此外，定制绿茶康普茶中还检测到杨梅素、牡荆素、山奈酚、芦丁、香豆酰奎宁酸及其衍生物等酚类化合物，这些成分在其他绿茶康普茶研究中也有报道（Candela 等，2020；Gondoin 等，2010；S. Li 等，2023；Mallmann 等，2023）。

3.2 体外抗氧化分析

三种浓度康普茶（25、125、250μL・mL⁻¹）的体外抗氧化能力如图 2 所示。酚类化合物除直接抗氧化作用外，还可通过激活酶类（如 SOD）和非酶类（如谷胱甘肽 GSH）抗氧化防御系统发挥间接抗氧化作用（Li 等，2023），其中 GSH 是人体重要的内源性非酶抗氧化剂（Eruslanov & Kusmartsev，2010）。谷胱甘肽实验以 H₂O₂为氧化剂，评估样品作为外源性抗氧化剂抑制 GSH 氧化、增强机体防御能力的潜力。结果显示（图 2a），所有测试浓度的定制绿茶康普茶均未能抑制 H₂O₂诱导的 GSH 氧化（p>0.05），表明其无法阻止该活性物质导致的巯基氧化损耗。

图 2 定制康普茶的体外抗氧化作用。结果以平均值 ± 标准差表示，不同字母表示差异具有统计学意义（p < 0.05）。GSH—谷胱甘肽；H₂O₂—过氧化氢；25、125、250—含有 25、125、250 μL・mL⁻¹ 康普茶的试管组。

脱氧核糖实验结果显示，相同浓度的康普茶均不能清除羟自由基，且 125μL・mL⁻¹ 和 250μL・mL⁻¹ 浓度组的羟自由基生成率显著高于对照组（p<0.05）。康普茶中可能含有锌、铜、铁、锰、钴等矿物质，这些矿物质可能与 H₂O₂发生芬顿反应生成羟自由基（Eruslanov & Kusmartsev，2010；Hardinsyah 等，2023；Jayabalan 等，2014）。需谨慎解读该结果，因为体外研究存在一定局限性，需结合更能模拟生理条件的体内实验，以深入理解机体中活性物质的生成与清除机制。

3.3 毒性分析

为全面评估定制绿茶康普茶的抗氧化作用，本研究采用秀丽隐杆线虫作为体内实验模型，该模型已广泛应用于体内氧化应激参数评估（Li 等，2023）。康普茶对秀丽隐杆线虫的直接影响结果如图 3 所示。与对照组相比，三种浓度（25、125、250μL・mL⁻¹）的康普茶暴露后，线虫存活率无显著变化（图 3a，p>0.05），表明定制绿茶康普茶无毒性。这与现有文献结果一致：Ferreira de Miranda 等（2023）和 Silva 等（2021）发现，以阿拉伯咖啡浸出液、茶叶、木槿为底物制备的康普茶对大蜡螟体内模型无毒性；黑莓提取物发酵的康普茶对人体皮肤细胞和酵母模型无细胞毒性（Ziemlewska 等，2023）。

图 3 定制康普茶对秀丽隐杆线虫存活率及活性物质（RS）生成的直接影响。结果以平均值 ± 标准差表示，不同字母表示差异具有统计学意义（p < 0.05）。C—— 对照组；25、125、250—— 暴露于 25、125、250 μL・mL⁻¹ 康普茶的线虫组。

关于康普茶对活性物质生成的影响，与对照组相比，康普茶暴露未诱导线虫产生活性物质（图 3b，p>0.05），且康普茶处理组的 DCF 荧光强度显著低于对照组（图 3b，p<0.05），呈现剂量依赖性——康普茶浓度越高，氧化 DCF 的定量值越低。据我们所知，本研究首次评估了不同浓度标准化绿茶康普茶的效果，为确定兼具健康益处且无毒性的饮用剂量提供了参考。

3.4 体内抗氧化分析

人体会自然产生多种活性物质（Eruslanov & Kusmartsev，2010），当活性物质生成超过抗氧化防御能力时，会引发氧化应激，进而诱发多种疾病。因此，膳食抗氧化剂的作用备受关注（Chakravorty 等，2019）。康普茶富含抗氧化剂（主要为酚类化合物），可通过电子捐赠或金属螯合作用中和多种活性物质（Abaci 等，2022）。Williamson 等（2005）指出，酚类化合物的抗氧化活性可增强体内抗氧化能力。因此，本研究评估了定制康普茶在秀丽隐杆线虫模型中的抗氧化作用，通过 H₂O₂诱导线虫氧化损伤，结果如图 4 所示。

图 4 定制康普茶对秀丽隐杆线虫氧化应激相关指标的影响。结果以平均值 ± 标准差表示，不同字母表示差异具有统计学意义（p < 0.05）。C—对照组；H₂O₂—过氧化氢；25、125、250—同时暴露于 300 mM 过氧化氢和 25、125、250 μL・mL⁻¹ 康普茶的线虫组。

正如预期，H₂O₂处理显著增加了线虫的活性物质生成、脂质过氧化水平，并降低了存活率（p<0.05，图 4b、c、d）。值得注意的是，与对照组相比，H₂O₂处理未显著影响 SOD 荧光强度（图 4a，p>0.05），但观察到 SOD 荧光强度有下降趋势。

DCF 实验可通过检测活性物质氧化 DCFH-DA 产生的荧光强度，反映样品的氧化还原状态。三种浓度（25、125、250μL・mL⁻¹）的康普茶均显著抑制了 H₂O₂诱导的 DCF 荧光强度升高（图 4b，p<0.05），表明其对该活性物质具有清除作用。Ziemlewska 等（2023）也发现，以黑果腺肋花楸、黑加仑、欧洲越橘提取物发酵的康普茶，可通过 0.1mM H₂O₂诱导氧化应激，降低细胞内 ROS 水平。

125μL・mL⁻¹ 和 250μL・mL⁻¹ 浓度的标准化绿茶康普茶使 DCF 荧光强度降至低于对照组水平（p<0.05）。与此同时，这两个浓度组的 SOD 酶荧光强度显著升高（图 4a），表明 SOD 表达增加。SOD 是体内抗氧化防御的关键酶，负责催化超氧阴离子歧化生成 H₂O₂。尽管酚类化合物可在体内清除超氧阴离子（Cao 等，1996），且 H₂O₂处理呈现抑制 SOD 荧光的趋势，但不能排除定制康普茶中的酚类化合物通过清除超氧阴离子，减少了 SOD 酶的消耗，从而使 125μL・mL⁻¹ 和 250μL・mL⁻¹ 浓度组线虫的 SOD 表达水平更高。

所有浓度的康普茶均显著抑制了 H₂O₂诱导的脂质过氧化（TBARS 水平）（图 4c，p<0.05）。过氧自由基（ROO・）半衰期长且可自由穿过细胞膜，常被用于评估生物抗氧化活性（Sun 等，2015）。多项研究表明，EGCG（本研究中康普茶的主要酚类化合物之一）对 ROO・具有保护作用（Oz，2017；Peluso & Serafini，2017；Tao 等，2016）。值得强调的是，酚类化合物的抗氧化活性与其化学结构相关，进而影响其抗氧化机制（Olszowy，2019）。儿茶素的有益作用与其结构中的羟基和没食子酰基密切相关——EGCG 可提供阳离子终止过氧自由基链反应，直接清除活性物质，避免其损伤脂质、蛋白质、DNA 等细胞内靶点（Nishidai 等，2000）。此外，酚类化合物还可通过核因子红细胞 2 相关因子 2（Nrf2）通路间接激活抗氧化酶表达（Augusti 等，2021）。

事实上，He 等（2018）证实 EGCG 是对抗 H₂O₂诱导氧化应激最有效的儿茶素。因此，定制绿茶康普茶中高含量的 EGCG 可能是其对秀丽隐杆线虫发挥 H₂O₂抗氧化保护作用的主要原因。尽管康普茶在 DCF、SOD 和 TBARS 实验中均表现出积极效果，但所有浓度均未能阻止 H₂O₂诱导的线虫存活能力下降（图 4d，p<0.05）。这与 Tang 等（2023）的研究结果不同，他们发现苹果和哈密瓜发酵的康普茶可在高温（35℃）和 H₂O₂应激下，改善秀丽隐杆线虫的 SOD 荧光强度、脂质过氧化水平和存活率。需注意的是，该研究使用的 H₂O₂浓度（2mM）远低于本研究（300mM），因此推测本研究中高浓度 H₂O₂造成的严重毒性无法被康普茶缓解，导致线虫存活率下降。H₂O₂氧化过程产生的毒性产物可能在体内系统中引发细胞抑制甚至凋亡（Ziemlewska 等，2023）；活性氧及其引发的细胞 redox 变化可启动凋亡信号传导（Kannan & Jain，2000）。因此，本研究中 H₂O₂诱导的线虫存活能力下降可能涉及氧化应激以外的机制（如凋亡），而这些机制无法被康普茶完全覆盖。Keaney 等（2004）证实，SOD 荧光强度增加并不一定能提高秀丽隐杆线虫的存活率或寿命。据我们所知，本研究首次报道了以食糖 Komagataeibacter 菌、异常布勒弹酵母和马克斯克鲁维酵母为微生物起始菌群的绿茶康普茶的酚类化合物谱及体内抗氧化潜力。

4 结论

以食糖 Komagataeibacter 菌、异常布勒弹酵母和马克斯克鲁维酵母为定制起始菌群制备的绿茶康普茶，经 HPLC-DAD-MS/MS 分析鉴定出 35 种酚类化合物，其中主要为黄烷 - 3 - 醇类，且 EGCG 含量较高。EGCG 是茶叶中生物活性最强的化合物，具有抗炎、抗氧化等多种健康益处。标准化绿茶康普茶未表现出体外抗氧化能力，但在所有测试浓度下对秀丽隐杆线虫均无毒性，且能在体内抑制 H₂O₂诱导的活性物质生成和脂质过氧化。此外，高浓度康普茶可使 SOD 荧光强度升高至对照组以上，但所有浓度均未能保护秀丽隐杆线虫免受 H₂O₂诱导的存活能力下降。

本研究结果表明，每日饮用 600mL 定制绿茶康普茶可能是最佳摄入量，该剂量对应体内实验中表现出抗氧化作用的 125μL・mL⁻¹ 浓度，且具有饮用可行性。研究结果为标准化绿茶康普茶的安全功能性每日摄入量建议提供了科学依据。